引物长度（引物长度多少合适）

今天给各位分享引物长度的知识，其中也会对引物长度多少合适进行解释，如果能碰巧解决你现在面临的问题，别忘了关注本站，现在开始吧！

为什么在进行pcr扩增引物设计中通常要求引物长度为20nt以上

引物浓度：引物浓度尽量按照酶的说明书给的浓度，自己再那个浓度再设置一个范围去摸索一下。也可以按照师兄师姐给的经验浓度自己去摸索一下，因为有时候说明书给的参数会是错的！这个真的很坑，所以第一次做的实验一定要找师兄师姐问清楚具体的参数和细节，避免走弯路、浪费试剂。不同的酶对引物浓度也可能会有点差别。引物浓度太低或太高了都会导致P不出来。有极少数情况，可能引物公司合成回来的引物F/R不对，比如R引物少了一半，所以引物溶解之后测一下浓度，自己根据OD和引物长度对应的摩尔量换算一下看对不对，但是这样的情况很少，我三年只遇到过一次，这样公司真的很坑爹！（因为我一模一样的重复了两次EMSA，发现结果跟之前的不对，最后排除问题发现是引物的一条少了一半，当时浪费了我一整天的时间，真的很心酸，这种奇葩的问题都能被我遇到。）如果是的话，和公司反应重新合成就行了。还有就是引物是否降解。

引物设计是否合理：这个你可以设计好之后，让师兄师姐帮忙检查一下，避免设计的引物有问题，导致后面实验不断重复还找不到原因。

3）DNA聚合酶：我们实验室用的是KOD FX，这个酶很好用，扩增能力很强，保真性也挺高。酶要保存在-20，用的时候也要放在冰上，加完就尽快放回-20，这样对酶的保护是比较好的，避免因为保存不当，一管酶用到后面活性下降了，导致扩增不出来。有时候一种酶扩增不出来就换一种试试，实验只能不断尝试了，失败多了就有自己的经验了。用之前一定要认真看说明书，有时候认真看了说明书，你还能学到一些知识。

引物设计原则是什么？

一、引物设计有3条基本原则：

1、引物与模板的序列要紧密互补。

2、引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。

3、再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。

二、PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。

扩展资料：

引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右，至少要在55-80℃之间，Tm值曲线以选取72度附近为佳，5'到 3’的下降形状也有利于引物与模板的结合；

ΔG值（自由能）反应了引物与模板结合的强弱程度，3'端的ΔG值相对要低，且绝对值不要超过9，否则不利于正确引发反应，3'末端双链的ΔG值在0--2kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，但在-6时只达到40%，-8时少于20%，-10时接近于0。

参考资料来源：百度百科-引物设计

【科研】PCR引物设计原则

引物设计是决定PCR反应成败的最重要因素。引物设计有两个主要考虑因素：特异性和扩增效率。特异性是由错配的频率决定的，特异性差的引物易产生错误的扩增产物。扩增效率是指引物以每循环增加两倍扩增产物达到理论最优的能力。

遵循原则如下：

1. 引物长度：引物的最佳长度为24或25个碱基左右。但是如果需要调整Tm值，引物的长度可以控制在21至28个碱基之间。当扩增≥10 kb长片段时，25-35个碱基之间的引物可以提供更好的结果。引物过短，会降低产物的特异性，每增加一个核苷酸，引物特异性可以提高 4 倍。引物过长，会使退火过程不完全，与模板结合不充分，以至引起扩增产物的明显减少。

2. 引物末端： 引物3’端最后一个碱基最好为G或者C；引物 3’端应避免出现发夹结构。

3. 引物G+C：含量 引物的GC含量控制在40%-60%之间。

4. Tm值：引物额外附加序列，即与模板非互配对序列，不应参与引物 Tm 的值计算；正向引物和反向引物的Tm值相差不超过5℃为佳，Tm值调整至55℃ -65℃为佳。

5. 碱基的分布：引物 A、G、C、T整体分布要尽量均匀，避免使用GC或者AT含量高的区域；避免连续出现4个及以上的相同碱基，或者某两个核苷酸连续重复出现（例如，ACCCC或ATATATAT；引物内部或者两条引物之间避免有5个碱基以上的互补序列；两条引物的 3’端避免有3个碱基以上的互补序列。

6. 序列特异性：引物设计完毕请使用 NCBI BLAST功能检索引物特异性，以避免非特异性扩增产生。注意: PCR的产量通常取决于PCR引物的3’端，引物间形成二聚体会降低扩增效率。

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